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Mick Whyet
Geregistreerd op: 10 Mei 2020
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 Geplaatst: 10-05-2020 07:22:47 Onderwerp: Puma 2019 |
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Im Gegensatz dazu erfahren mit der Puma 2019 Kontroll-siRNA transfizierte U87MG-Zellen eine signifikante Anisomycin-induzierte Apoptose (45,5%). Im Assay repräsentieren die gelb zusammengeführten Signale kernfragmentierte DNA. Wie erwartet zeigten unbehandelte Zellen keinen Hinweis auf Apoptose (Daten nicht gezeigt). Das Western Blot (3b) zeigte, dass die PUMA-Expression durch die PUMA-spezifische siRNA spezifisch und effizient herunterreguliert wurde.
Auswirkungen der Herunterregulierung der PUMA-Expression und der erhöhten EGFRvIII-Expression auf die Induktion von Apoptose in GBM-Zellen. Das Ausmaß der Apoptose wird berechnet als: (Anzahl der apoptotischen Kerne) / (Gesamtzahl der Kerne). In beiden Panels wurden 250-300 Zellen Puma Basket Platform in jedem Experiment untersucht und drei unabhängige Experimente wurden durchgeführt, um Mittelwerte und Standardabweichungen abzuleiten. (A) Der Abbau der PUMA-Expression macht GBM-Zellen resistent gegen Apoptose, wie durch den TUNEL-Assay angezeigt.
Als Puma Bmw Negativkontrollen verwendetes Maus-IgG ergab kein Signal, was auf die Spezifität des Assays hinweist. Es fällt auf, dass die endogenen EGFR-Spiegel durch Staurosporin in T98G-Zellen leicht reduziert wurden (rechtes Feld). Dies ist möglicherweise auf eine Caspase-vermittelte Spaltung nach Staurosporin-Behandlung zurückzuführen [39].
EGFR und EGFRvIII existieren beide im Komplex mit PUMA konstitutiv und die Wechselwirkungen werden unter apoptotischem Stress aufrechterhalten. U87MG-EGFR- Puma Creepers und U87MG-EGFRvIII-stabile Transfektanten und T98G-GBM-Zellen mit endogenem EGFR wurden mit 1% DMSO und 1 uM Apoptose-induzierendem Staurosporin (ST) behandelt, geerntet und einer Immunpräzipitation / Western Blot (linkes Feld) und Western Blot (rechts) unterzogen Panel), wie zuvor beschrieben.
Es ist bekannt, dass sich PUMA auf den Mitochondrienmembranen befindet, um bei entsprechendem Stress Apoptose auszulösen [40; 41]. Rationalisiert durch unsere Daten, die zeigen, dass EGFR und EGFRvIII PUMA coexprimieren und mit PUMA interagieren und dass diese beiden Wege umgekehrt Puma Damen mit Apoptose verbunden sind, untersuchten wir, ob EGFR / EGFRvIII die subzelluläre Lokalisation von PUMA regulieren könnte. Daher analysierten wir die zytoplasmatische / mitochondriale Verteilung von PUMA im isogenen Paar U87MG-EGFRvIII- und U87MG-Vektorzellen.
PUMA wird im Zytoplasma von EGFR- und EGFRvIII-exprimierenden GBM- und Brustkrebszellen unabhängig von apoptotischem Stress sequestriert. Das Ausmaß der mitochondrialen PUMA-Translokalisierung, der mtPUMA-Index, wird wie zuvor unter Materialien und Methoden beschrieben berechnet. (A) PUMA ist hauptsächlich im Zytoplasma von U87MG-EGFRvIII-Zellen lokalisiert. U87MG-EGFRvIII-Zellen, die mit Vehikelkontrolle, Staurosporin (ST, 1 uM) oder Anisomycin (AN, 100 ng / ml) behandelt wurden,  wurden geerntet und in mitochondriale und nicht mitochondriale Fraktionen fraktioniert. |
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